科普 | 经典CRISPR/Cas分子诊断系统（一）

CRISPR/Cas系统来源于细菌的免疫系统，在原核生物中，CRISPR-Cas系统作为免疫系统，利用CRISPR RNAs（crRNAs）作为引导分子，靶向识别入侵核酸，在抵御外来病毒入侵。其发挥免疫的功能包括适应、表达和干扰3个阶段^[1]。在适应阶段，细菌通过Cas蛋白（Cas1和Cas2）捕捉入侵的外来核酸，并整合至自身基因组的CRISPR 序列中形成记忆功能，以便下次出现入侵时，细菌可启动免疫反应；在表达阶段，CRISPR 序列转录生成前体crRNA (pre-crRNA)和反式激活RNA(trans-activating crRNA, tracrRNA)，pre-crRNA通过加工，形成含有与外来基因序列匹配的crRNA，crRNA与tracrRNA通过碱基配对形成向导RNA（single-guide RNA，sgRNA），用于Cas蛋白的募集；在干扰阶段，sgRNA引导Cas蛋白定位到与其同源的外来核酸靶标，并激活Cas蛋白的内切酶活性，对靶标核酸进行切割，从而发挥免疫功能。

在基因编辑领域，CRISPR/Cas9最早被应用，其在诊断领域的开发也有报道。该系统通过把Cas9和PCR进行结合开发了一种针对寨卡病毒分型的特异性检测方法，该方法通过sgRNA特异性识别只存在于美国寨卡病毒基因组中的PAM序列，在3小时内对不同亚型进行精确区分^[2]。但由于时间长且需要变温反应，该系统在诊断产品开发方向并未广泛应用。麻省理工的张锋和加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna两位学者不但在CRISPR基因编辑上做出奠基性贡献，也对CRISPR在分子诊断行业的应用做了开拓性工作，开启了CRISPR分子诊断这一全新领域。下面我们就来具体了解下张锋团队的SHERLOCK诊断系统和Jennifer Doudna的DETECTR诊断系统。

核酸的快速检测对于临床诊断和生物技术的应用是不可或缺的。张锋团队建立的核酸预扩增与CRISPR-Cas结合的基于CRISPR的诊断平台称SHERLOCK^[3]，其主要运用Cas13a与sgRNA复合物特异性识别靶RNA后激活其非特异性降解其他RNA的功能。SHERLOCK通过进一步优化，升级成了SHERLOCK v2，可进行高灵敏度的多重、定量检测，结合侧向层析技术还可实现可视化检测。该系统可应用在病原检测、基因型区分、耐药性基因以及肿瘤液体活检的即时检测等领域。以该技术为基础开发的新冠检测产品在2020年5月获得了新冠检测的EUA，成为全球第一个注册获批的CRISPR诊断试剂。

DETECTR在2018年由Jennifer Doudna团队研发，是另一种基于CRISPR系统的诊断方法^[4]。该方法基于LbCas12a蛋白开发，同样该蛋白具有反式切割活性，不同的是其对单链DNA（ssDNA）有较高的切割活性。DETECTR系统从流程上更有优势，不仅步骤上更少，而且所用到的探针为ssDNA探针，合成便宜且保存稳定。逻辑和SHERLOCK类似，就是将靶标序列的信号快速转换为荧光信号，不仅起到放大的作用，也起到了特异识别的作用。经测试和验证，该系统能够从临床样本中快速而准确地检测出与宫颈癌相关的16和18型的HPV，具有高特异性。

CRISPR技术自问世以来，在诊断领域发展迅速。我们在这里介绍了代表性的CRISPR诊断平台SHERLOCK诊断系统以及DETECTR诊断系统，各平台所呈现的特点不尽相同, 但基于该诊断平台的分子诊断技术都具有简单、快速的特点。不同特性Cas蛋白的发现，丰富了检测核酸类型的选择，从dsDNA到ssDNA再到RNA均可作为CRISPR/Cas分子诊断系统的靶序列，结合各种可视化反应，为分子即时诊断的应用带来更多发展可能。随着学者的不断研究，该技术的延展性和潜力巨大。