引言
世界卫生组织(WHO)认为理想的检测外来病原体方法应是快速、特异、灵敏、无需复杂仪器、且具有成本效益。目前的病原体核酸检测方法(典型的是PCR方法)具有许多局限性，例如需要复杂的仪器和试剂、专门的PCR实验室、经过训练的技术人员，而且检测耗时长。因此迫切需要研发快速、灵敏、特异、成本低的新型核酸检测方法，尤其是可用于不同场景的床旁诊断装置。
上篇文章我们介绍了SHERLOCK和DETECTR两种新方法基于CRISPR-Cas效应分子的体外特性，将活化的核酸酶与特异性核酸结合，然后这些效应分子与各种报告基团结合，并同时联合等温扩增方法，建立了在多种模式下的高灵敏度检测方法[1]。今天我们来看一下HOLMES诊断系统和CDetection诊断系统，进一步探索CRISPR/Cas系统的性能、功能、以及作为感染性疾病最佳诊断工具的应用前景。
HOLME诊断系统
几乎与DETECTR系统开发同时，国内王金教授团队同样利用Cas12a的反式切割活性开发了HOLMES系统[2-3]。与前两种系统不同的是，HOLMES系统通过PCR步骤实现模板扩增。在此基础上，该团队又做了多种实验，证明了ssDNA和dsDNA靶标都能激活Cas12a的反式切割活性，包括证明了多个物种的Cas12a都有反式切割活性，为后面HOLMES体系中的Cas12a筛选提供了基础。随后，该团队又基于LAMP-Cas12b开发了HOLMES v2系统[4]，并开发了One-Pot一步法CRISPR诊断体系，同时，HOLMESv2可与digital PCR体系联用实现对靶标核酸的绝对定量。测试数据显示，Cas12b的反式切割活性对ssDNA的亲和力要好于dsDNA，具有更宽的反应温度范围，而且灵敏度与Cas12a相当。
HOLMES/v2核酸检测方法
CDetection诊断系统
由中国科学院周淇院士团队开发的具有独立知识产权的CDetection诊断系统，采用具有较宽反应温度范围（25-60℃）和pH稳定性（1-8）的AaCas12b，通过AaCas12b-sgRNA复合物特异性识别靶标基因后，激活其反式切割活性，高效的切割体系内ssDNA荧光报告分子，从而发出荧光信号，该系统能够适应不同环境下的检测条件。使用RT-RAA和Cas12b优化系统成分和反应条件，该团队开发了一种Cas12b辅助的one-pot检测平台（CDetection v2），能够在30分钟内快速检测SARS-CoV-2，而不与其他病毒交叉反应[5-6]。
CDetection v2检测结果的可视化
CRISPR/Cas系统在感染诊断中的应用前景
CRISPR/Cas系统毫无疑问为感染性疾病的诊断提供了新的方法和契机，总结来说，它具有如下优点：1、相较于基于PCR的传统方法，毫不逊色的灵敏度和特异度。2、检测所需时间短。3、简单便携，不依赖昂贵的仪器和严苛的实验环境。4、试剂耐受冷冻干燥，便于储存和携带。5、标本前处理可以非常简单。6、结果读取方便，能通过荧光或者肉眼读取结果。这几大优点使得CRISPR检测平台可以对病原体核酸分子实现实时快速检测。
在PCR（第一代）、NGS（第二代）分子诊断平台之后，CRISPR核酸检测技术无疑会成为第三代分子诊断平台。第一代PCR核心优势是单指标核酸靶标的精确定量；第二代NGS核心优势是高通量，多靶标的并行检测；第三代CRIPSR分子诊断平台突出优势可以用一句通俗的话描述“一张纸，几分钟，随时随地的诊断”。也就是说，CRISPR诊断就是在不减少灵敏度特异性的情况下，可实现不需要实验室和专业操作人员，从应用场景和性能看，实现居家或临床/现场快检，等同或超过PCR实验室检测结果。
参考文献
[1] Mustafa M I , Makhawi A M .SHERLOCK and DETECTR: CRISPR-Cas Systems as Potential Rapid Diagnostic Tools for Emerging Infectious Diseases[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2021, 59(3).
[2] Li L, Li S, Wang J.CRISPR-Cas12b-assisted nucleic acid detection platform [J].Cold Spring Harbor Laboratory, 2018(10).
[3] Li L, Li S, Wu N,et al. HOLMESv2:a CRISPR-Cas12b-assisted platform for nucleic acid detection and DNA methylation quantitation[J].ACS Synthetic Biology, 2019 Oct 18;8(10):2228-2237.
[4] Lv H , Wang J , Zhang J ,et al.Definition of CRISPR Cas12a Trans-Cleavage Units to Facilitate CRISPR Diagnostics[J].Frontiers in Microbiology, 2021.
[5] Teng F , Guo L , Cui T ,et al.CDetection: CRISPR-Cas12b-based DNA detection with sub-attomolar sensitivity and single-base specificity [J].Genome biology, 2019, 20(1):132.
[6] Wang X, Chen Y, Cheng X, et al. CDetection.v2: One-pot assay for the detection of SARS-CoV-2. Front Microbiol. 2023 Mar 23;14:1158163.
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